《PNAS》解讀：糖基化修飾影響酶活和蛋白互作！

O-糖基化修飾（O-GlcNAcylation）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)蛋白絲氨酸或者蘇氨酸殘基上的單糖修飾，其失調(diào)與腫LIU等人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明O-糖基化修飾在結(jié)直腸AI等多種腫LIU中明顯上調(diào)，然而其促進(jìn)腫LIU發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

2024年10月24日，浙江大學(xué)易文和朱強(qiáng)共同通訊在PNAS（IF=9.4）上發(fā)表了題為“O-GlcNAcylation of enolase 1 serves as a dual regulator of aerobic glycolysis and immune evasion in colorectal cancer”的研究成果。揭示O-糖基化通過調(diào)控烯醇化酶（enolase 1, E***）來影響結(jié)直腸AI糖代謝以及免疫逃逸的機(jī)制，強(qiáng)調(diào)干預(yù)E***糖基化可以作為結(jié)腸AI臨床治L的潛在策略。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）E***在腫LIU組織中的表達(dá)明顯上調(diào)；

2）E***的酶活性是CRC細(xì)胞增殖和腫LIU生長(zhǎng)所必需的；

3）E***在蘇氨酸19（T19）上的O-糖基化增強(qiáng)了其酶活性；

4）抑制E***兩個(gè)位點(diǎn)的糖基化能聯(lián)合PD-L1單抗協(xié)同抑制結(jié)直腸腫LIU生長(zhǎng)；

5）E***中絲氨酸249（S249）上的糖基化則抑制其與PD-L1的相互作用，并阻斷泛素連接酶STUB1介導(dǎo)的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進(jìn)了 PD-L1蛋白表達(dá)，進(jìn)而JI活 PD-1/ PD-L1 介導(dǎo)的腫LIU免疫逃逸。

臨床相關(guān)性：

E***在腫LIU組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。

功能研究：

E***的T19 O-糖基化促進(jìn)糖酵解和結(jié)直腸腫LIU生長(zhǎng)；S249 O-糖基化抑制抗腫LIU活性并促進(jìn)結(jié)直腸腫LIU生長(zhǎng)。

機(jī)制研究：

（1）確定E***的O-糖基化修飾2個(gè)位點(diǎn)T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性

第一步，E***存在O-糖基化修飾

越來越多的證據(jù)表明，O-糖基化會(huì)影響幾種關(guān)鍵代謝酶的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。為了確定E***是否被O-糖基化修飾，化學(xué)酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OGA（O-連接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物體內(nèi)唯YI水解蛋白質(zhì)O-糖基修飾的糖苷酶。）抑制劑TMG或?O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）過表達(dá)的情況下，O-糖基化信號(hào)明顯升高（圖1a）。隨后用質(zhì)量標(biāo)記方法分析E***的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子與疊氮標(biāo)記的糖蛋白結(jié)合，導(dǎo)致WB信號(hào)的分子移位。通過量化移位帶和未移位帶之間的強(qiáng)度之比，發(fā)現(xiàn)正常條件下，內(nèi)源性E***的修飾率約為27%（圖1b）。在不同濃度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清時(shí)，E*** O-糖基化水平呈劑量依賴性增加（圖1c-e）。

第二步，鑒定E***上的O-糖基化位點(diǎn)

共表達(dá)HA-OGT和Flag-E***后，anti-Flag IP-MS質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)E***上鑒定到4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（T19、T26、S27和S249）。分別構(gòu)建T19A、T26A、S27A和S249A突變體進(jìn)行化學(xué)酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，T19A和S249A突變體明顯降低了O-糖基化信號(hào)。雙位點(diǎn)突變（T19A/S249A）使糖基化信號(hào)減少了約80%，表明T19和S249是E***上主要的糖基化位點(diǎn)（圖1f-g）。此外，不同物種之間的序列比較表明，T19和S249都是進(jìn)化保守的（圖1h）。

第三步，E*** T19上的O-糖基化影響其酶活

E***敲除后外源表達(dá)WT、T19A或S249A E***發(fā)現(xiàn)，T19A突變體，而不是S249A突變體，表現(xiàn)出明顯的活性降低（圖1i），使用TMG或過表達(dá)OGT處理同樣增加了WT和S249A E***的活性，但對(duì)T19A突變體沒有明顯影響（圖1i）。另外，在大腸桿菌中的共表達(dá)OGT和UDP-GlcNAc合成途徑中的關(guān)鍵酶，進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果（圖1j）。表明E*** T19上的O-糖基化影響其酶活。

第四步，T19 O-糖基化促進(jìn)形成E***二聚體增加E***活性

T19糖基化如何調(diào)控E***的活性？酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在OGT過表達(dá)的情況下，WT和S249A E***產(chǎn)生2-p-甘油的比較大速度（Vmax）都比T19A E***高得多（圖1k）。隨后研究T19糖基化是否會(huì)影響E***的低聚物化狀態(tài)。Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T19A E***破壞E***之間的結(jié)合；TMG處理則增強(qiáng)WT之間的互作，但沒有增強(qiáng)T19A E***之間的互作（圖1l）。另外，使用水溶性的交聯(lián)劑BS3（可與蛋白質(zhì)上的伯胺（-NH2）反應(yīng)，以穩(wěn)定E***的寡聚化狀態(tài)）處理，發(fā)現(xiàn)O-糖基化增加了WT E***二聚體蛋白的數(shù)量，但對(duì)T19A突變體沒有明顯影響（圖1m）。表明T19 O-糖基化通過促進(jìn)E***活性二聚體的形成來促進(jìn)E***活性。

圖1 確定E***的O-糖基化修飾2個(gè)位點(diǎn)T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性（Ref. Fig 2/S2）

（2）E***的S249 O-糖基化通過抑制STUB1和PD-L1的結(jié)合促進(jìn)PD-L1的穩(wěn)定性

據(jù)報(bào)道，E***可以通過結(jié)合PD-L1增強(qiáng)PD-L1與E3連接酶STUB1的關(guān)聯(lián)，從而增加細(xì)胞中PD-L1的降解。

第一步，預(yù)測(cè)分析E***和PD-L1之間的互作

基于AlphaFold2預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)位于與PD-L1相互作用界面的E***的四個(gè)關(guān)鍵殘基（N52、K54、K197和E250）（圖2a-b）。

第二步，E***的E250介導(dǎo)與PD-L1相互作用

對(duì)每個(gè)殘基構(gòu)建N52A、K54A、K197A和E250A突變體，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)E250突變?yōu)楸彼幔‥250A）明顯降低了E***與PD-L1之間的相互作用（圖2c）。另外，分析還發(fā)現(xiàn)E***的E250能夠與PD-L1上的R125形成臨界鹽橋，從而增強(qiáng)相互作用的穩(wěn)定性（圖2a）。表明E***的E250在介導(dǎo)PD-L1相互作用中的重要作用。

第三步，E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用

構(gòu)建全長(zhǎng)E***及其各種截?cái)嗤蛔凅w（N端區(qū)域、DNA結(jié)合域和C端區(qū)域），GST pulldown實(shí)驗(yàn)顯示只有全長(zhǎng)的E***和E***的C端區(qū)域（包含S249糖基化位點(diǎn)）顯示出與PD-L1的結(jié)合信號(hào)（圖2d）。提示靠近關(guān)鍵E250殘基的S249上的大量糖基化修飾可能會(huì)破壞與PD-L1的相互作用。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)WT E***明顯減少PD-L1水平；而過表達(dá)S249A E***，且無(wú)論是否存在OGT過表達(dá)，PD-L1均無(wú)明顯變化（圖2e-f）。進(jìn)一步探討E*** O-糖基化對(duì)WT、T19A或S249A E***與內(nèi)源性PD-L1相互作用的影響。Co-IP分析顯示，過表達(dá)WT或T19A E***后，OGT過表達(dá)增加O-糖基化水平，但降低了E***與PD-L1互作，并伴有PD-L1蛋白水平的升高，而在過表達(dá)S249A E***的細(xì)胞中沒有觀察到這種作用（圖2g-h）。類似的，TMG處理也增加了WT E***重組細(xì)胞中的PD-L1蛋白水平，但在S249A重組細(xì)胞中沒有（圖2i-j）。表明E***上E250附近S249糖基化抑制其與PD-L1互作，降低PD-L1的蛋白水平。

第四步，E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達(dá)

Qpcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OGT的過表達(dá)并未改變PD-L1 mRNA水平，表明PD-L1的調(diào)控機(jī)制與轉(zhuǎn)錄無(wú)關(guān)（圖2k）。分析PD-L1的半衰期，發(fā)現(xiàn)TMG可促進(jìn)WT E***過表達(dá)細(xì)胞中PD-L1的穩(wěn)定性，但對(duì)S249A E***過表達(dá)細(xì)胞無(wú)促進(jìn)作用。此外，蛋白酶體抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑氯喹（CQ）或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），挽救了S249A E***過表達(dá)細(xì)胞中PD-L1的降解（圖2l），表明E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達(dá)。

圖2 E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用（Ref. Fig 4/S4/S5）

第五步，E***促進(jìn)PD-L1與STUB1的結(jié)合

據(jù)報(bào)道，E***通過募集E3連接酶STUB1調(diào)節(jié)PD-L1的蛋白酶體降解。敲減STUB1，PD-L1表達(dá)增加（圖3a）。IP-WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-L1泛素化降低，證實(shí)STUB1是CRC細(xì)胞中PD-L1的E3連接酶（圖3a）。此外，E***的缺失增加了PD-L1水平，IP-WB顯示PD-L1泛素化降低，重新表達(dá)WT E***逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（圖3b-c）。相反，過表達(dá)E***可抑制PD-L1的表達(dá)，敲減STUB1，則抑制作用被消除（圖3d）。另外，內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E***的缺失抑制PD-L1與STUB1互作（圖3e），而E***過表達(dá)則以劑量依賴性的方式增強(qiáng)PD-L1與STUB1互作（圖3f）。GST pulldown實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該結(jié)果（圖3g）。表明E***促進(jìn)了PD-L1與STUB1的結(jié)合。

第六步，E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解

推測(cè)E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（圖3h）。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，在WT E***過表達(dá)細(xì)胞中，TMG處理后，降低PD-L1泛素化及其與STUB1的互作，但在S249A E***過表達(dá)細(xì)胞中沒有降低（圖3i）。此外，WB檢測(cè)顯示，過表達(dá)OGT可增強(qiáng)WT E***過表達(dá)細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，而在S249A E***過表達(dá)細(xì)胞中則無(wú)此作用。而敲減STUB1抵消這種增加（圖3j）。

表明E***糖基化阻斷了其與PD-L1的相互作用，減少了STUB1與PD-L1的相互作用，從而抑制了STUB1介導(dǎo)的泛素化和PD-L1的蛋白酶體降解。

圖3 E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（Ref. Fig 4/S6/S7）

結(jié)論：研究人員發(fā)現(xiàn)E***的表達(dá)水平在結(jié)腸AI組織中明顯上調(diào)。功能上，E***促進(jìn)腫LIU生長(zhǎng)。機(jī)制上，質(zhì)譜分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提示蘇氨酸19位（T19）以及絲氨酸249位(S249)是E***上主要的糖基化修飾位點(diǎn)。一方面，T19的糖基化通過促進(jìn)活性二聚體的形成提高了其酶活性，促進(jìn)腫LIU生長(zhǎng)；另一方面，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)S249的糖基化抑制了E***與PD-L1的互作，并阻斷了STUB1介導(dǎo)的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進(jìn)了 PD-L1蛋白表達(dá)，進(jìn)而JI活 PD-1/ PD-L1 介導(dǎo)的腫LIU免疫逃逸。此外，抑制E***兩個(gè)位點(diǎn)的糖基化能聯(lián)合PD-L1單抗協(xié)同抑制結(jié)直腸腫LIU生長(zhǎng)。提示E***的糖基化在結(jié)直腸AI臨床免疫治L和檢測(cè)中具有重要的意義。