CARM1與HIF1A互作結(jié)合至多個(gè)靶點(diǎn)啟動(dòng)子

《Protein Cell》解讀：CARM1與HIF1A互作結(jié)合至多個(gè)靶點(diǎn)啟動(dòng)子，協(xié)調(diào)促進(jìn)三陰性乳腺AI（TNBC）的進(jìn)展

乳腺AI 就占女性AI癥的31%。女性乳腺AI 發(fā)病率一直在緩慢上升。三陰性乳腺AI （TNBC）惡性程度更高，且無(wú)有效治LIAO ，預(yù)后差。精氨酸甲基化是一種關(guān)鍵的翻譯后修飾（PTM），參與各種細(xì)胞過(guò)程。然而，關(guān)于CARM1在TNBC中的功能知之甚少。

2024年10月，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院和首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在Protein Cell（IF=13.6）上發(fā)表了題為“CARM1 drives triple-negative breast cancer progression by coordinating with HIF1A”的研究成果。揭示CARM1在TNBC中AI 變的分子基礎(chǔ)及其有效的天然抑制劑，可能為AI癥治LIAO 提供新的思路和藥物。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）CARM1在乳腺AI 樣本中高表達(dá)，與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)；

2）CARM1促進(jìn)TNBC進(jìn)展；

3）CARM1與HIF1A協(xié)同促進(jìn)TNBC的進(jìn)展；

4）CARM1由HIF1A募集，占據(jù)CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子，這些基因在細(xì)胞周期、HIF-1信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，從而調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞的增殖和侵襲。

臨床相關(guān)性：

CARM1在乳腺AI 樣本中高表達(dá)。

功能研究：

過(guò)表達(dá)CARM1在體內(nèi)、外促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲、EMT和干細(xì)胞潛能，CARM1敲減則相反。

機(jī)制研究：

（1）鑒定CARM1的全基因組轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)

通過(guò)anti-CARM1 ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，共鑒定出17,749個(gè)carm1特異性結(jié)合峰和4,866個(gè)獨(dú)特的啟動(dòng)子基因（圖1a）。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與HIF-1、Wnt、VEGF等信號(hào)通路（圖1b）。ChIP-qpcr檢測(cè)顯示，CARM1在CARM1、CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1, MAT2A、VEGFA和Vimentin等啟動(dòng)子上強(qiáng)富集，驗(yàn)證了ChIP-seq結(jié)果（圖1c）。對(duì)所選基因進(jìn)行anti-H3R17me2a和anti-H3R26me2a ChIP-qpcr分析，顯示H3R17me2a和H3R26me2a占據(jù)了目標(biāo)啟動(dòng)子（圖1d）。進(jìn)一步表明，這些啟動(dòng)子被CARM1占據(jù)。敲減CARM1進(jìn)行RNA-seq，KEGG分析顯示W(wǎng)nt、HIF-1和VEGF信號(hào)通路富集（圖1e-f），這與ChIP-seq數(shù)據(jù)一致。此外，ChIP-seq中的啟動(dòng)子基因（P < 0.001）與RNA-seq中下調(diào)的基因重疊（圖1g）。RT-qPCR和WB驗(yàn)證了CARM1敲低引起的變化（圖1h-i）。

圖1 鑒定CARM1的全基因組轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)（Ref. Fig 3）

（2）CARM1與HIF1A存在關(guān)聯(lián)并直接相互作用

第一步，篩選CARM1的互作蛋白

通過(guò)anti-Flag-CARM1 IP-MS鑒定與CARM1相互作用的蛋白，分析顯示CARM1與HIF1A存在關(guān)聯(lián)（圖2a）。

第二步，驗(yàn)證CARM1與HIF1A相互作用

在常氧和缺氧條件下，進(jìn)行Co-IP分析，CARM1和HIF1A相互作用（圖2b-e）。此外，GST pulldown實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CARM1與HIF1A互作（圖2f-g）。

第三步，確定CARM1與HIF1A互作具體的位置

構(gòu)建截短載體GST-CARM1-EVH1結(jié)構(gòu)域（1-140 aa）、GST-CARM1-cat（141-480 aa）和GST-CARM1-c（481-608 aa），進(jìn)行GST pulldown實(shí)驗(yàn)，表明CARM1的EVH1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與HIF1A相互作用（圖2h-j）。此外，構(gòu)建突變體進(jìn)行GST pulldown實(shí)驗(yàn)，CARM1-?EVH1（141-608 aa）不能與HIF1A相互作用，甲基轉(zhuǎn)移酶失活的CARM1-R168A突變體不影響CARM1與HIF1A的相互作用（圖2k），即這種相互作用不是一種翻譯后修飾（PTM）的方式。同樣，構(gòu)建GST-HIF1A bHLH結(jié)構(gòu)域（1-80 aa）、GST-HIF1A-PAS （81-350 aa）、GST-HIF1A-ODD （351-600 aa）和GST-HIF1A-TAD（601-826 aa）進(jìn)行GST pulldown實(shí)驗(yàn)，顯示HIF1A的TAD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與CARM1相互作用（圖2l-m）。

第四步，CARM1與HIF1A互作結(jié)合CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子，調(diào)控其表達(dá)

接下來(lái)，用含缺氧反應(yīng)元件（HREs）的pGL4.42載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)常氧和缺氧條件下熒光素酶的活性（圖2n），發(fā)現(xiàn)CARM1直接調(diào)控缺氧信號(hào)通路。BIOBASE分析顯示CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子都具有潛在的HIF-1結(jié)合序列（圖2o）。表明，CARM1直接與HIF1A相互作用，并調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖2 CARM1與HIF1A存在物理關(guān)聯(lián)并直接相互作用（Ref. Fig 4/S4）

（2）HIF1A招募CARM1促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄激HUO 

HIF1A是一種激HUO 基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。前面的研究顯示CARM1與HIF1A互作，推測(cè)HIF1A/CARM1構(gòu)成了一個(gè)激HUO 復(fù)合體，其功能是促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。

第一步，CARM1與HIF1A形成一個(gè)復(fù)合體，結(jié)合到下游靶標(biāo)啟動(dòng)子區(qū)

為了探究HIF1A與CARM1互作的功能意義，分別在常氧和缺氧條件下，進(jìn)行anti-CARM1和anti-HIF1A ChIP-qpcr實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示CARM1和HIF1A共同占據(jù)了這些靶標(biāo)（圖3a-b）。

第二步，CARM1與HIF1A形成一個(gè)復(fù)合體，結(jié)合到下游靶標(biāo)啟動(dòng)子區(qū)

為了驗(yàn)證關(guān)于CARM1和HIF1A作為蛋白復(fù)合物占據(jù)目標(biāo)啟動(dòng)子的假設(shè)，在缺氧條件下進(jìn)行ChIP-qpcr實(shí)驗(yàn)。CARM1敲低明顯降低了HIF1A與CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1、SIX1和VEGFA啟動(dòng)子的結(jié)合，反之亦然（圖3c-f）。同時(shí)，在敲低CARM1或HIF1A后，所有目標(biāo)啟動(dòng)子的H3R17me2a和RNA聚合酶II （RNA polymerase II, Pol II）水平均明顯降低（圖3c-f）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè)，對(duì)六個(gè)具有代表性的靶基因CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1進(jìn)行ChIP或ChIP-re-ChIP檢測(cè)?？扇苄匀旧|(zhì)用anti-CARM1、HIF1A和H3R17me2a IP。以H3R17me2a為陽(yáng)性對(duì)照。隨后使用抗體對(duì)免疫沉淀物進(jìn)行再免疫沉淀。結(jié)果表明，在沉淀物中，被anti-CARM1免疫沉淀的CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1啟動(dòng)子可以被anti-HIF1A或H3R17me2a再次免疫沉淀（圖3g）。當(dāng)使用anti-HIF1A或H3R17me2a進(jìn)行初始ChIP檢測(cè)時(shí)，獲得類似的結(jié)果（圖3g）。

即HIF1A和CARM1作為一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物占據(jù)CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子。

另外，在缺氧條件下敲減HIF1A或CARM1下調(diào)CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的mRNA和蛋白水平表達(dá)（圖3h）。綜上所述，HIF1A和CARM1作為一個(gè)整體與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，并相互促進(jìn)其募集和/或穩(wěn)定，共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激HUO 的功能。

圖3 HIF1A招募CARM1促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄激HUO （Ref. Fig 5）

結(jié)論：研究人員發(fā)現(xiàn)CARM1在乳腺AI 表達(dá)上調(diào)。功能上，CARM1上調(diào)與乳腺AI 進(jìn)展相關(guān)，促進(jìn)TNBC的增殖、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞干性。CARM1的全基因組分析表明，CARM1占據(jù)CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子，這些基因在細(xì)胞周期、HIF-1、Wnt、VEGF信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。機(jī)制上，CARM1與HIF1A互作，并由HIF1A募集，占據(jù)CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動(dòng)子，從而調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞的增殖和侵襲。此外，CARM1的抑制劑鞣花酸可以通過(guò)直接抑制CDK4的表達(dá)來(lái)抑制TNBC的增殖和侵襲。該研究確定了CARM1AI 變的分子基礎(chǔ)及其有效的天然抑制劑，為AI癥治LIAO 提供新的思路和藥物。