面對(duì)日益嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)和可預(yù)期降低的儀器購置成本，數(shù)字PCR將在食品檢測(cè)領(lǐng)域起到越來越重要的作用：同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的量值的溯源方式，也將成為轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的主要研究方向。發(fā)展dPCR協(xié)同分析和自動(dòng)化程度，使其具有更好兼容性、更低廉的成本，可使數(shù)據(jù)結(jié)果不間斷地納入到全食品安全全產(chǎn)業(yè)鏈中，從而在未來的食品檢測(cè)中得到更廣的應(yīng)用。dPCR多重檢測(cè)可在不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，在同一分析過程中同時(shí)測(cè)定單一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因與參考基因的比率，提高檢測(cè)的效率節(jié)省重復(fù)操作。從市場(chǎng)規(guī)模來看，目前數(shù)字PCR市場(chǎng)規(guī)模并不大，全球約1.5億至2.5億美元。廣州雙螺旋生物儀器數(shù)字PCR技術(shù)基于數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，塔歌生...

作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 ...

作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 ...

數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)。數(shù)字PCR為不同應(yīng)用場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在臨床檢測(cè)方面，在 性疾病早期檢測(cè)、 疾病的伴隨診斷、生殖遺傳篩查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)在商業(yè)化應(yīng)用方面，也不斷“攻城略地”。新羿生物在檢測(cè)及 疾病伴隨診斷方面開發(fā)了一系列試劑盒，并積極推進(jìn)注冊(cè)臨床試驗(yàn)；領(lǐng)航基因聚焦在血流 （膿毒癥）及呼吸道 領(lǐng)域，相繼推出了多款病原菌檢測(cè)試劑盒；銳訊生物聚焦于檢測(cè)，2020年其產(chǎn)品獲得FDA緊急授權(quán)。除此之外，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)針對(duì)食源性致病菌、鼠疫、蟲媒...

數(shù)字PCR系統(tǒng)通過其獨(dú)特的微流體陣列式芯片板（MAP）技術(shù)，提供強(qiáng)大而易于使用的數(shù)字PCR體驗(yàn)。這種專有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行一致的自動(dòng)腔室化，可將一份樣品腔室化至20,000個(gè)微反應(yīng)室，其變異系數(shù)（CV）達(dá)到比較好的<1%。與其它數(shù)字PCR系統(tǒng)不同，MAP技術(shù)不使用乳液或其它基于液滴的方法對(duì)反應(yīng)進(jìn)行腔室化。而是利用分配通道將試劑遞送至微反應(yīng)室，具有高精密度和一致性。此外，QuantStudioAbsoluteQ系統(tǒng)可分析加載樣品的95%以上，確保獲得高度準(zhǔn)確的數(shù)字PCR結(jié)果。數(shù)字PCR的**原理：有限稀釋、終點(diǎn)PCR和泊松分布。法國(guó)數(shù)字PCR市場(chǎng)前景數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子...

數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)。數(shù)字PCR為不同應(yīng)用場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在臨床檢測(cè)方面。國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)在商業(yè)化應(yīng)用方面，也不斷“攻城略地”。數(shù)字PCR作為當(dāng)下靈敏的核酸檢測(cè)技術(shù)，盡管目前國(guó)產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)異軍突起，在臨床市場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)了彎道超車，但未來仍然需要聚焦客戶需求，不斷夯實(shí)底層創(chuàng)新，同時(shí)在檢測(cè)成本、自動(dòng)化、試劑盒申報(bào)注冊(cè)、出海國(guó)際化等方面不斷努力，提供更為的解決方案。國(guó)際局勢(shì)，波譎云詭。在百年未有之大變局，實(shí)現(xiàn)中華民族的偉大復(fù)興，需要國(guó)內(nèi)企業(yè)瞄準(zhǔn)技術(shù)高地，以爭(zhēng)分奪秒的精神，解決技術(shù)"卡脖子"的難題，不斷...

引物設(shè)計(jì)（DesignPrimers）：引物長(zhǎng)度（PrimerLength）：18-25個(gè)堿基之間。短的引物更易于同靶序列結(jié)合，但過短的引物也更可能同基因組上的多個(gè)區(qū)域相結(jié)合而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。更長(zhǎng)的引物會(huì)提高同靶序列結(jié)合的特異性，但過長(zhǎng)的引物（>30bp）同靶序列結(jié)合速度變慢，降低結(jié)合率。引物長(zhǎng)度和組成直接影響引物Tm值（PrimerMeltingTemperature）和退火溫度（AnnealingTemperatures）。引物的組成——GC%含量（GCContent）：指引物總堿基中G和C堿基數(shù)量的百分比，該值應(yīng)在40-60%之間。如果模板序列的GC含量較高，推薦使用較高Tm值的引...

PCR常使用目標(biāo)序列的拷貝數(shù)或某一給定樣品中轉(zhuǎn)基因的百分比來體現(xiàn)方法靈敏度。由于qPCR和dPCR實(shí)驗(yàn)過程所用試劑的兼容性較好，在使用dPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)，通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術(shù)對(duì)相同樣品檢測(cè)時(shí)，兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關(guān)注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765個(gè)微單元）芯片數(shù)字PCR分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD413檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810。該小組應(yīng)用dPCR技術(shù)評(píng)估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值，在拷貝數(shù)200-700之間，dPCR與qPCR的測(cè)量結(jié)果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比，dPCR在低于拷貝數(shù)2...

作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 ...

在定量PCR時(shí)，我們常常糾結(jié)一個(gè)問題，究竟是相對(duì)定量還是***定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因?yàn)閿?shù)字PCR（digitalPCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計(jì)起始樣品中的核酸量，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測(cè)定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)...

數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計(jì)規(guī)則同熒光定量PCR是類似的，具體規(guī)則如下：1、查找和選擇目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區(qū)域：基因的保守區(qū)域是指來自同一屬/種/亞型的、在某個(gè)基因上堿基序列差別很小或沒有差別的區(qū)域。根據(jù)需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對(duì)齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對(duì)齊序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并確保引物結(jié)合位點(diǎn)處的保守序列與其它非待檢測(cè)的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產(chǎn)物長(zhǎng)度=下游引物位置-上游引物位置+1）。3D數(shù)字PCR是基于納米流...

盡管我國(guó)dPCR行業(yè)起步較晚，但在國(guó)家鼓勵(lì)醫(yī)療器械創(chuàng)新的大背景下，以及精細(xì)醫(yī)療和個(gè)性化用藥等需求推動(dòng)下，dPCR成為了近年廣受關(guān)注的熱點(diǎn)領(lǐng)域，保持著穩(wěn)定快速的增長(zhǎng)。近年來國(guó)內(nèi)誕生了如領(lǐng)航基因、新羿生物、銳訊生物、科維思、永諾生物、泛生子、思納福醫(yī)療等企業(yè)，開始與國(guó)外企業(yè)同臺(tái)競(jìng)技。從市場(chǎng)角度看，北美依然是dPCR比較大的主導(dǎo)市場(chǎng)，其次是亞洲和歐洲。由于性疾病和的高發(fā)病率以及患者對(duì)這些疾病的早期診斷意識(shí)的提高，亞太地區(qū)將成為dPCR增長(zhǎng)速度快的市場(chǎng)。伯樂、凱杰、賽默飛、羅氏、因美納等公司紛紛通過收購、投資等方式布局dPCR業(yè)務(wù)。dPCR的結(jié)果統(tǒng)計(jì)方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色，另一種采用概率統(tǒng)...

20世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。檢測(cè)結(jié)果部分為陽性，部分為陰性，之后進(jìn)行分子數(shù)統(tǒng)計(jì)，不需做標(biāo)曲。華南地區(qū)雙螺旋生物儀器數(shù)字PCR熒光通道根據(jù)泊松分布的定義和適用條件可知，...

相比于cPCR技術(shù)和第二代qPCR技術(shù)，dPCR技術(shù)具有定量，可溯源至SI國(guó)際單位制摩爾；基質(zhì)成分干擾較小[51]；靈敏度高；對(duì)抑制劑的敏感性較低；適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[52.53]，可提高分析效率；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化簡(jiǎn)單[54]對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，可為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供準(zhǔn)確的量值保證，目前dPCR儀器的價(jià)格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價(jià)格將會(huì)不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測(cè)中。dPCR的測(cè)量結(jié)果通常表示為含量，即拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。上海賽默飛數(shù)字PCR分析應(yīng)用3D數(shù)...

相比于qPCR，dPCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）檢測(cè)靈敏度高：理論上dPCR的靈敏度可達(dá)1個(gè)拷貝，而實(shí)際應(yīng)用中dPCR的小檢出限和比較低定量限數(shù)值非常接近，所以dPCR可以在非常低的目標(biāo)拷貝數(shù)下得到精確的結(jié)果；通常轉(zhuǎn)基因比參考基因（內(nèi)源基因）濃度低很多；（2）前處理簡(jiǎn)單且受基質(zhì)成分干擾較?。篸PCR反應(yīng)效率和精密度受到食品基質(zhì)成分干擾影響較小，可應(yīng)用于混合基質(zhì)樣品中低豐度DNA的檢測(cè)；（3）dPCR對(duì)抑制劑的敏感性較低：由于dPCR結(jié)果表示為“有熒光“或“無熒光”，即使存在抑制劑降低了熒光強(qiáng)度仍可以表示為“有熒光；（4）適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)：食品或飼料提取的DNA中可能包含多種轉(zhuǎn)基因片...

ThermoFisherQuantStudio3D是另一個(gè)經(jīng)典的芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)，其基本的檢測(cè)流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在有20000個(gè)微孔的芯片上，將芯片放在PCR儀上擴(kuò)增，將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號(hào)。操作較為復(fù)雜，整個(gè)過程在封閉的芯片中進(jìn)行，污染的風(fēng)險(xiǎn)較低。STILLANaica是一個(gè)較新的數(shù)字PCR平臺(tái)，基本的檢測(cè)流程是：將反應(yīng)液加入芯片，將芯片放入微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)，生成30,000個(gè)微滴單層平鋪于芯片中，PCR擴(kuò)增在芯片上完成。然后將擴(kuò)增后的芯片轉(zhuǎn)移至微滴閱讀分析系統(tǒng)，采取拍照的方式讀取熒光信號(hào)。由于整個(gè)過程在封閉的芯片中進(jìn)行，污染...

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢(shì)，梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與溯源技術(shù)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）方面的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴(kuò)增過程大致上可以分為3步：樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴(kuò)增和樣品的檢測(cè)。對(duì)于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng)，各個(gè)部件之間仍然有較大的改進(jìn)空間，要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的，而且有持續(xù)研究的價(jià)值。表1中總結(jié)了部分常見的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型，以及相對(duì)在硬件、便攜性、性價(jià)比和自動(dòng)化程度...

使用ddPCR的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于，定量不是相對(duì)的。微滴式數(shù)字PCR計(jì)算事件的數(shù)量，因此可以確定檢測(cè)極限和比較低起始量，以便達(dá)到所需的靈敏度。在連續(xù)監(jiān)控或比較不同患者的效果時(shí)，這可以更準(zhǔn)確地比較負(fù)荷，因?yàn)樗鶞y(cè)得的豐度不是相對(duì)的。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ddPCRKRASG12/G13ScreeningKit也能夠檢測(cè)患者cfDNA樣品中的KRAS突變（圖2）。這些患者的血漿樣品購自ConversantBio和ProMedDx，之前已通過FFPE基因分型被分為KRAS突變陽性或陰性。歡迎咨詢廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司。檢測(cè)結(jié)果部分為陽性，部分為陰性，之后進(jìn)行分子數(shù)統(tǒng)計(jì)，不需做標(biāo)曲。上海進(jìn)口數(shù)字PCR系統(tǒng)數(shù)字...

數(shù)字PCR技術(shù)流分類目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統(tǒng)。微液滴制備的方法，目前主流的有四種：1）芯片微孔物理分割法，俗稱物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗稱油包水，代替公司有Bio-Rad;3）雜交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振動(dòng)制滴法。PS：芯片式物理分割技術(shù)所有已經(jīng)過期，目前有不少公司在這個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行開發(fā)，例如羅氏。數(shù)字PCR是通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子 。深圳銳訊數(shù)字...

產(chǎn)物越短，往往擴(kuò)增效率越高。模板二級(jí)結(jié)構(gòu)（Templatesecondarystructure）：PCR變性中和變性后的單鏈DNA不夠穩(wěn)定，容易自發(fā)折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)避免可形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板鏈區(qū)域，因?yàn)槿绻０彐溞纬傻亩?jí)結(jié)構(gòu)在退火溫度下穩(wěn)定存在，定位在模板鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)處的引物將無法同模板鏈相結(jié)合。使用mfold可預(yù)測(cè)引物待結(jié)合的區(qū)域是否存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，盡量使引物定位在模板二級(jí)結(jié)構(gòu)以外的序列上。避免具有4個(gè)以上相同的連續(xù)堿基的區(qū)域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸階段聚合酶“滑動(dòng)（PolymeraseSlippage）”。選擇GC含量（GCC...

根據(jù)泊松分布的定義和適用條件可知，如果我們?cè)O(shè)微液滴總數(shù)為N，投入的靶序列拷貝數(shù)為M，那么“每個(gè)微液滴中的靶序列拷貝數(shù)”的概率分布是近似滿足泊松分布的。理解之前，首先要明確一點(diǎn)，在檢測(cè)的過程中，并不是說一個(gè)樣本中檢測(cè)到了幾個(gè)亮點(diǎn)，這個(gè)反應(yīng)當(dāng)中就有幾個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因?yàn)槟繕?biāo)基因的片段，在微滴當(dāng)中的分布，是符合泊松分布的（也就是說進(jìn)不進(jìn)的概率相等，并且相互獨(dú)立）。所以，一個(gè)發(fā)光的微滴中，可能有一個(gè)或者三個(gè)四個(gè)，甚至更多個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因此，發(fā)光的微滴數(shù)與原始的基因拷貝數(shù)并不是一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系。影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。德...

面對(duì)日益嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)和可預(yù)期降低的儀器購置成本，數(shù)字PCR將在食品檢測(cè)領(lǐng)域起到越來越重要的作用：同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的量值的溯源方式，也將成為轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的主要研究方向。發(fā)展dPCR協(xié)同分析和自動(dòng)化程度，使其具有更好兼容性、更低廉的成本，可使數(shù)據(jù)結(jié)果不間斷地納入到全食品安全全產(chǎn)業(yè)鏈中，從而在未來的食品檢測(cè)中得到更廣的應(yīng)用。dPCR多重檢測(cè)可在不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，在同一分析過程中同時(shí)測(cè)定單一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因與參考基因的比率，提高檢測(cè)的效率節(jié)省重復(fù)操作。數(shù)字PCR適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域。上海一體化數(shù)字PCR解決方案盡管我國(guó)dPCR行業(yè)起步較晚，但在國(guó)家鼓勵(lì)醫(yī)療器械創(chuàng)新的大背...

常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測(cè)定在各種條件上不會(huì)完全一致，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可以進(jìn)行定量。如何在雙通道設(shè)置及雙探針標(biāo)記的情況下實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)?不同位點(diǎn)的雙探針檢測(cè)體系中引物和探針采用不同的終濃度，這樣陽性微滴的終點(diǎn)FAM/HEX熒光信號(hào)強(qiáng)度就會(huì)不同，利用陽性微滴不同的“分簇(cluster)”來區(qū)分不同的突變位點(diǎn)。采用對(duì)應(yīng)的KRAS野生型和突變型細(xì)胞系對(duì)雙重ddPCR檢測(cè)體系的性能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示除了Q61H位點(diǎn)外，其他位點(diǎn)的檢測(cè)體系在54C的情況下均能很好的區(qū)...

了解泊松分布，我們先要從二項(xiàng)式分布說起，二項(xiàng)式分布是一個(gè)離散概率分布，它給出了m次試驗(yàn)中k次成功的可能性，每次試驗(yàn)的概率為p，例如當(dāng)擲骰子時(shí)，二項(xiàng)分布給出了在10次試驗(yàn)中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中，投擲骰子類似于將一個(gè)目標(biāo)實(shí)體隨機(jī)“投擲”到一組分區(qū)中，當(dāng)目標(biāo)落在選定的分區(qū)中時(shí)，就是成功。如果有n個(gè)分區(qū)，并且分區(qū)過程是完全隨機(jī)的，則目標(biāo)出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗(yàn)重復(fù)m次，樣品中的每個(gè)分子一次。如下所示的二項(xiàng)式分布給出了k個(gè)成功的概率，即所選分區(qū)恰好包含k個(gè)分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當(dāng)n很大，并且嘗試成功的概率(1/n)很小時(shí)，二項(xiàng)分布可以近似為泊松分布...

了解泊松分布，我們先要從二項(xiàng)式分布說起，二項(xiàng)式分布是一個(gè)離散概率分布，它給出了m次試驗(yàn)中k次成功的可能性，每次試驗(yàn)的概率為p，例如當(dāng)擲骰子時(shí)，二項(xiàng)分布給出了在10次試驗(yàn)中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中，投擲骰子類似于將一個(gè)目標(biāo)實(shí)體隨機(jī)“投擲”到一組分區(qū)中，當(dāng)目標(biāo)落在選定的分區(qū)中時(shí)，就是成功。如果有n個(gè)分區(qū)，并且分區(qū)過程是完全隨機(jī)的，則目標(biāo)出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗(yàn)重復(fù)m次，樣品中的每個(gè)分子一次。如下所示的二項(xiàng)式分布給出了k個(gè)成功的概率，即所選分區(qū)恰好包含k個(gè)分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當(dāng)n很大，并且嘗試成功的概率(1/n)很小時(shí)，二項(xiàng)分布可以近似為泊松分布...

目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于...

目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于...

相比于cPCR技術(shù)和第二代qPCR技術(shù)，dPCR技術(shù)具有定量，可溯源至SI國(guó)際單位制摩爾；基質(zhì)成分干擾較小[51]；靈敏度高；對(duì)抑制劑的敏感性較低；適合多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[52.53]，可提高分析效率；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化簡(jiǎn)單[54]對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，可為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供準(zhǔn)確的量值保證，目前dPCR儀器的價(jià)格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價(jià)格將會(huì)不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測(cè)中。通過“儀器+試劑”相互配合的方式，打出了數(shù)字PCR檢測(cè)的“組合拳”。法國(guó)銳訊數(shù)字PCR性能特點(diǎn)國(guó)產(chǎn)品牌市場(chǎng)份額的不斷擴(kuò)大，固然有、貿(mào)易戰(zhàn)...

使用ddPCR的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于，定量不是相對(duì)的。微滴式數(shù)字PCR計(jì)算事件的數(shù)量，因此可以確定檢測(cè)極限和比較低起始量，以便達(dá)到所需的靈敏度。在連續(xù)監(jiān)控或比較不同患者的效果時(shí)，這可以更準(zhǔn)確地比較負(fù)荷，因?yàn)樗鶞y(cè)得的豐度不是相對(duì)的。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ddPCRKRASG12/G13ScreeningKit也能夠檢測(cè)患者cfDNA樣品中的KRAS突變（圖2）。這些患者的血漿樣品購自ConversantBio和ProMedDx，之前已通過FFPE基因分型被分為KRAS突變陽性或陰性。歡迎咨詢廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司。數(shù)字PCR是定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種定量的方法。法國(guó)賽默...

數(shù)字PCR產(chǎn)品的發(fā)展，為不同場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面，在 性疾病早期檢測(cè)、病癥的液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn) 性疾病早期高效檢測(cè)——以病毒為例，有病毒檢測(cè)、和臨床樣本病毒載量評(píng)估He監(jiān)測(cè)環(huán)境病毒載量；二代熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是目前病毒檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但由于病毒探針結(jié)合位點(diǎn)突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測(cè)過程中經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，由于數(shù)字PCR具有更高的靈敏度、精細(xì)度，以及其適合痕量樣本檢測(cè)的特性，能夠檢測(cè)出熒光定量PCR檢測(cè)過程中錯(cuò)過的 ，可作為后者的補(bǔ)充。在人群篩查及臨床診療中，為科學(xué)選取采樣...