數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計(jì)規(guī)則同熒光定量PCR是類(lèi)似的，具體規(guī)則如下：1、查找和選擇目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區(qū)域：基因的保守區(qū)域是指來(lái)自同一屬/種/亞型的、在某個(gè)基因上堿基序列差別很小或沒(méi)有差別的區(qū)域。根據(jù)需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對(duì)齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對(duì)齊序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并確保引物結(jié)合位點(diǎn)處的保守序列與其它非待檢測(cè)的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產(chǎn)物長(zhǎng)度=下游引物位置-上游引物位置+1）。3D數(shù)字PCR是基于納米流體芯片進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)一次檢測(cè)，將樣品分到數(shù)千個(gè)單獨(dú)的PCR。美國(guó)全自動(dòng)多重?cái)?shù)字PCR性能特點(diǎn)
數(shù)字PCR技術(shù)流分類(lèi)目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類(lèi)系統(tǒng)。微液滴制備的方法，目前主流的有四種：1）芯片微孔物理分割法，俗稱(chēng)物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗稱(chēng)油包水，代替公司有Bio-Rad;3）雜交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振動(dòng)制滴法。PS：芯片式物理分割技術(shù)所有已經(jīng)過(guò)期，目前有不少公司在這個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行開(kāi)發(fā)，例如羅氏。全自動(dòng)數(shù)字PCR儀器數(shù)字PCR的兩大應(yīng)用場(chǎng)景在于基因檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)出生缺陷篩查。
根據(jù)泊松分布的定義和適用條件可知，如果我們?cè)O(shè)微液滴總數(shù)為N，投入的靶序列拷貝數(shù)為M，那么“每個(gè)微液滴中的靶序列拷貝數(shù)”的概率分布是近似滿(mǎn)足泊松分布的。理解之前，首先要明確一點(diǎn)，在檢測(cè)的過(guò)程中，并不是說(shuō)一個(gè)樣本中檢測(cè)到了幾個(gè)亮點(diǎn)，這個(gè)反應(yīng)當(dāng)中就有幾個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因?yàn)槟繕?biāo)基因的片段，在微滴當(dāng)中的分布，是符合泊松分布的（也就是說(shuō)進(jìn)不進(jìn)的概率相等，并且相互獨(dú)立）。所以，一個(gè)發(fā)光的微滴中，可能有一個(gè)或者三個(gè)四個(gè)，甚至更多個(gè)目標(biāo)基因的拷貝。因此，發(fā)光的微滴數(shù)與原始的基因拷貝數(shù)并不是一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
作為時(shí)下的熱點(diǎn)技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨(dú)、平行的微反應(yīng)單元（nL，納升級(jí)別）中，使得每個(gè)反應(yīng)單元中盡可能含有1個(gè)模板分子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的比較 計(jì)數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢(shì)：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴(lài)內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標(biāo)；三是微反應(yīng)單元相互獨(dú)立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴(kuò)增產(chǎn)物間的相互干擾，準(zhǔn)確度和可重復(fù)性較高?？截悢?shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。
dPCR的測(cè)量結(jié)果通常表示為含量，即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以qPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以拷貝數(shù)（單倍體基因組當(dāng)量）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示特性量；以dPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來(lái)表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會(huì)造成測(cè)量結(jié)果不可比。因此質(zhì)量分?jǐn)?shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關(guān)系需要轉(zhuǎn)化，才能得到單位一致，數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分?jǐn)?shù)。經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。數(shù)字PCR原理
通過(guò)創(chuàng)新技術(shù)微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應(yīng)耗材價(jià)格進(jìn)入個(gè)位數(shù)，實(shí)現(xiàn)了新的進(jìn)步，也降低開(kāi)發(fā)難度。美國(guó)全自動(dòng)多重?cái)?shù)字PCR性能特點(diǎn)
引物設(shè)計(jì)（DesignPrimers）：引物長(zhǎng)度（PrimerLength）：18-25個(gè)堿基之間。短的引物更易于同靶序列結(jié)合，但過(guò)短的引物也更可能同基因組上的多個(gè)區(qū)域相結(jié)合而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。更長(zhǎng)的引物會(huì)提高同靶序列結(jié)合的特異性，但過(guò)長(zhǎng)的引物（>30bp）同靶序列結(jié)合速度變慢，降低結(jié)合率。引物長(zhǎng)度和組成直接影響引物Tm值（PrimerMeltingTemperature）和退火溫度（AnnealingTemperatures）。引物的組成——GC%含量（GCContent）：指引物總堿基中G和C堿基數(shù)量的百分比，該值應(yīng)在40-60%之間。如果模板序列的GC含量較高，推薦使用較高Tm值的引物。美國(guó)全自動(dòng)多重?cái)?shù)字PCR性能特點(diǎn)
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