基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基報(bào)價(jià)

    本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：，特別是涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法、改造抗體、細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞產(chǎn)品及其應(yīng)用。背景技術(shù)：：目前，常用的細(xì)胞體外培養(yǎng)方法大量應(yīng)用了細(xì)胞培養(yǎng)用抗體來(lái)結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞表面的特定受體分子，以達(dá)到***(activating)或是**(blocking)信號(hào)通路的目的，促使目標(biāo)細(xì)胞定向分化、持續(xù)擴(kuò)增或凋亡。在小規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，通常將這些抗體包被(coating)在培養(yǎng)皿表面，或是交聯(lián)到磁珠上。在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，為了避免冗長(zhǎng)的難以控制的包被過(guò)程，或是為了節(jié)省高昂的磁珠成本、避免引入外源物質(zhì)，或是出于其他優(yōu)化工藝的目的，經(jīng)常會(huì)將這些抗體直接加入培養(yǎng)基中。但是，這樣獲得的終產(chǎn)品普遍存在著純度較低、活力較低的問(wèn)題。目標(biāo)細(xì)胞純度低，意味著終產(chǎn)品中有過(guò)多的其他類(lèi)型的細(xì)胞。這些非目標(biāo)細(xì)胞的功能與目標(biāo)細(xì)胞的不同，其成分通常難以控制，會(huì)極大增加科學(xué)試驗(yàn)、特別是動(dòng)物和人體體內(nèi)試驗(yàn)的復(fù)雜程度，嚴(yán)重影響研究的重復(fù)性。同樣，在臨床***應(yīng)用上出于安全性和有效性考慮，獲得盡可能高的純度和高的活力的細(xì)胞制品也是進(jìn)行細(xì)胞***所必需的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種可提高細(xì)胞純度和活力的細(xì)胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明披露了一種細(xì)胞培養(yǎng)方法。DMEM高糖培養(yǎng)基的成分符合細(xì)胞生長(zhǎng)需求?；A(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基報(bào)價(jià)

    注射用重組人白介素-2)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基x-vivo5(lonza，04-418q)，完全培養(yǎng)基(x-vivo5，il-21000iu/ml)，celltiteraqueousonesolution(promega，g3580，即mts溶液)，okt3(takarabio，t210)。準(zhǔn)備抗體濃度梯度取96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，在孔內(nèi)加入100μl完全培養(yǎng)基。用完全培養(yǎng)基稀釋抗體至μg/ml，在第1列孔內(nèi)各加入100μl，混勻。從第1列向第11列孔內(nèi)做梯度稀釋(serialdilution)，即轉(zhuǎn)移100μl，混勻后，繼續(xù)向下一列轉(zhuǎn)移。**后，每個(gè)孔內(nèi)含100μl完全培養(yǎng)基，并形成了抗體的1:2稀釋梯度，從第1列的μg/ml到第11列的。細(xì)胞培養(yǎng)利用白細(xì)胞分離液分離人pbmc細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整密度至3e5/ml。在96孔板第1列至第11列孔內(nèi)各加入100μl細(xì)胞懸液，混勻。**后，每個(gè)孔內(nèi)含200μl完全培養(yǎng)基和3e4細(xì)胞，并形成了抗體的1:2稀釋梯度，從第1列的800ng/ml到第11列的。在37℃、5％co2培養(yǎng)5天。數(shù)據(jù)采集和處理每個(gè)孔內(nèi)加入20μlmts溶液。將平板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。用酶標(biāo)儀讀取490nm吸收光值。對(duì)讀數(shù)取均值，再扣除空白(blank，即第12列讀數(shù)的均值)。以抗體濃度/od做semi-log曲線(xiàn)，用4參數(shù)擬合方法(fourparameterlogisticregression)計(jì)算ed50。結(jié)果討論acd3-sh的ed50為(圖8。山東無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口DMEM高糖培養(yǎng)基可用于干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。

    每支凍干品中加入1ml上述培養(yǎng)基使其充分溶解，(此培養(yǎng)基為msc-cm培養(yǎng)基原液)，然后用上述配制的10％fcs的dmem/f12培養(yǎng)基稀釋msc-cm1和msc-cm2，制備5倍和10倍的msc-cm1和msc-cm2的稀釋培養(yǎng)基。②培養(yǎng)的hdf細(xì)胞達(dá)到80～90％融合后，％胰酶-edta消化，消化后的細(xì)胞用10％fcsdmem/f12培養(yǎng)基以5×104/ml重懸細(xì)胞，并將其接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)；③24h后棄原培養(yǎng)液，各組分別加入100ul步驟①配制的msc-cm1和msc-cm2原液、5x和10x培養(yǎng)基，每個(gè)msc-cm設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)空白培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基孔為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。④各觀察期終止時(shí)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入10μl/孔mtt液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去原液，加入100μl/孔產(chǎn)物溶解液。37度孵育4小時(shí)，取出震蕩10min，在酶標(biāo)儀上以570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。由于mtt可以被活細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體中的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑(洗滌劑或dmso)存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過(guò)酶標(biāo)儀可以測(cè)定570nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    如、糖尿病足等)和皮膚**老為目的的化妝品中，吸引了眾多的研究者開(kāi)發(fā)新的方法與技術(shù)，提高msc-cm的產(chǎn)量，增強(qiáng)其生物學(xué)功能，降低產(chǎn)品制備的成本。研究表明鋰離子是一種雙向調(diào)節(jié)的化合物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究表明適量的鋰元素有助于骨質(zhì)的形成，同時(shí)適量的鋰元素對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞也具有保護(hù)作用，培養(yǎng)基中低濃度的鋰離子可以促進(jìn)msc的增殖，而高濃度的鋰離子則會(huì)**msc的增殖與分化。普遍認(rèn)為，鋰離子有助于骨質(zhì)形成與神經(jīng)保護(hù)作用是由于鋰離子促進(jìn)了msc的增殖和分化，而對(duì)于是否鋰離子的使用使msc所分泌的活性因子有所增加，改善了細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，目前未見(jiàn)報(bào)道。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加低濃度的氯化鋰將有助于提高msc-cm中活性物質(zhì)的產(chǎn)量?，F(xiàn)有技術(shù)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基用于化妝品的制備方法在使用時(shí)，不僅使用效果不好，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中含有活細(xì)胞，在使用細(xì)胞時(shí)具有免*排斥、潛在的致*性、不易保存與運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)，而且間充質(zhì)干細(xì)胞的利用率低，提高了間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服以上技術(shù)缺陷，提供一種使用效果好、利用率高、成本低的一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基用于化妝品的制備方法。DMEM高糖培養(yǎng)基的配方適合大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型。

    吸去孵育液，加入試劑盒提供的洗液400ul/孔，洗滌3次，吸干洗液后，加入200ul/孔sdf-1α結(jié)合物，500rpm水平搖床室溫孵育2小時(shí)；⑤重復(fù)步驟③中的洗滌步驟，徹底吸干殘留洗液；⑥加入200ul/孔底物顯色液，室溫、避光反應(yīng)30分鐘后，每孔加入50ul終止液，于450nm波長(zhǎng)(使用570nm作為校正波長(zhǎng))讀取結(jié)果。⑦根據(jù)所測(cè)od值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(表1)，確定樣品中的sdf-1α的含量(表2)。⑧檢測(cè)結(jié)果：見(jiàn)附圖2。表1sdf-1alpha測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定兩個(gè)樣品msc-cm1和msc-cm2測(cè)定的od值及根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸公式所計(jì)算的sdf-1α在相應(yīng)樣品中的含量見(jiàn)下表：表2sdf-1α在相應(yīng)樣品中的含量實(shí)施例3msc-cm對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響的檢測(cè)msc-cm中生物活性分子的功能通過(guò)檢測(cè)msc-cm對(duì)人**成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響來(lái)進(jìn)行測(cè)定，人**成纖維細(xì)胞采用hdf(humandermalfiborblast，人**成纖維細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)cellapplications(cat#：106k-05a)，為16周歲人包皮細(xì)胞分離而來(lái))。mtt試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：c0009。①測(cè)試樣品培養(yǎng)基的制備：首先配制500ml含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基，備用(此培養(yǎng)基也是hdf細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，取2種不同方式制備的msc-cm凍干品。MEM培養(yǎng)基適用于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。黑龍江無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)

無(wú)血清培養(yǎng)基確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的純凈性?；A(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基報(bào)價(jià)

    圖15)和腫*影像結(jié)果(圖16)中可看到，來(lái)源于腫*細(xì)胞的熒光信號(hào)逐漸上升，小鼠逐漸死亡。g1組在26天達(dá)到中位生存期，在30天時(shí)全部死亡。g2組中，在51天達(dá)到中位生存期，在75天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)尚有2只存活。g3組中，在75天時(shí)有3只存活。g4組在61天**后一次成像檢測(cè)時(shí)6只皆存活，在75天時(shí)有5只存活。在整體存活率和腫*成像信號(hào)的比較上，聯(lián)合用*組的***效果數(shù)據(jù)都明顯優(yōu)于空白組和單獨(dú)用*組的。說(shuō)明利妥昔單抗與本發(fā)明得到的nk細(xì)胞聯(lián)合使用時(shí)的體內(nèi)adcc殺傷作用明顯。應(yīng)用實(shí)例4nk細(xì)胞產(chǎn)品在肝細(xì)胞****上的臨床研究本研究選擇晚期肝細(xì)胞*(hepatocellularcarcinoma，hcc)患者，輸入按照培養(yǎng)實(shí)例3中擴(kuò)增方法來(lái)制備的nk細(xì)胞產(chǎn)品，觀察病人的短期和長(zhǎng)期反應(yīng)，來(lái)初步探索采用同源異體高純度人nk細(xì)胞***方案的安全性與有效性。材料nk細(xì)胞經(jīng)過(guò)收集和清洗后配制為細(xì)胞制品，細(xì)胞活率大于90％，nk細(xì)胞純度大于90％。研究方法意向病人在通過(guò)入選和排除篩查后，開(kāi)始1-2個(gè)nk細(xì)胞***療程，每個(gè)療程間隔1-3月。每個(gè)療程包含2次nk細(xì)胞***，間隔5～10天。每次***輸入1～2e9個(gè)nk細(xì)胞，輸入前后記錄病人體征變化和主述。***個(gè)療程結(jié)束后開(kāi)始隨訪(fǎng)，直至***后2年或病人因各種原因退出本研究。基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基報(bào)價(jià)