南通快速冷凍顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術也正在成為助力醫(yī)藥研發(fā)的有力手段。依托對蛋白質結構的理解，科學家正在開發(fā)更有效的治Ca藥、打菌素、止痛藥、麻醉劑等。中國過去10多年里，建成了世界上較大的冷凍電鏡設施。中國的科學家，也在冷凍電鏡領域取得了很多舉世矚目的成就，引起了世界的普遍關注。比如清華大學的施一公團隊，對老年癡呆癥相關的重要蛋白質結構進行了解析，對于我們理解它的發(fā)病機理甚至開發(fā)重要治療方法有重要意義。他們對剪接體復合體一系列結構的研究幫助我們理解細胞的演化、細胞的基因調控和其他一些相關疾病有著重要意義。2019年，中國科學家利用冷凍電鏡技術解析到世界上目前分辨率較高的豬瘟病毒結構，這對我們了解該病毒的發(fā)病機理，以及如何更好開發(fā)疫苗具有重要意義。冷凍電鏡技術能夠提供生理環(huán)境下大分子復合物納米、亞納米甚至近原子尺度的原位結構信息。南通快速冷凍顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術中的電子斷層掃描技術與單顆粒分析法的比較：單顆粒分析法：它的優(yōu)點：解析生物大分子的理論分辨率可達原子級；樣品受總輻射值??；對稱顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結果越好；電子斷層掃描技術：優(yōu)點：簡單直接；對樣品的要求較低；常用于對細胞或者生物組織結構的三維重構；但是，對同一樣品位置多次拍照時，電子束對樣品的輻照損傷就會成為了比較嚴重的問題；當樣品旋轉角度受到電子束透過樣品厚度能力的限制。韶關低溫冷凍透射電鏡技術冷凍電鏡技術中單顆粒分析法優(yōu)點：樣品受總輻射值小；對稱顆粒的解析分辨率更高。

冷凍電鏡技術解析結構的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結構一般流程為：蛋白表達純化；負染樣品準備：約2小時完成；負染樣品的數(shù)據(jù)收集：約8小時完成；冷凍樣品的準備：約4小時完成；冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集：48-120小時完成。三維結構重建。冷凍電鏡解析蛋白結構對蛋白質的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機物質，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結構。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應在1mg/ml左右，膜蛋白應保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達標，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰，均一性大于90%。

冷凍電子顯微鏡技術步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過專門的設備一冷凍輸送器轉移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應重新制備樣品。由于生物樣品對高能電子的輻射敏感，照相時必須使用較小曝光技術。經(jīng)過透射電子顯微鏡中一系列復雜的過程，較終在記錄介質上會形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像。利用計算機對這些放大的圖像進行處理分析即可獲得樣品的精細結構。近年來，一個技術上的重大突破是高分辨率圖像采集設備的開發(fā)與應用?；诨パa金屬氧化物半導體(CMOS)技術開發(fā)的直接探測電子成像的裝置使電子顯微放大圖像的信噪比相對過去所使用的底片或電荷耦合元件(CCD)有了很大提高、進而提高了成像的質量。冷凍電子顯微鏡技術步驟樣品制備注意：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。

冷凍電鏡技術總結：電子斷層成像技術則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結構，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結構，的也可以了解整個細胞不同層面的內(nèi)部結構.盡管，我們能夠預言按目前電子冷凍斷層成像技術的發(fā)展會得到許多更誘人的信息。細胞內(nèi)存在大量分子機器和生物大分子復合物，并且與單個超分子相比要大，更容易對其進行識別。這樣的事實使斷層技術的目標變得簡單了。在不久的將來關于細胞骨架，核孔復合體和核纖層，囊泡聚集和運輸復合物以及其他一些細胞成分的一些基本問題會得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對樣品進行結晶，快速含水冰凍的制樣過程既不復雜，又保存了樣品的瞬時天然結構，有利于對復合物的功能進行研究，圖像自動化篩選過程將是今后提高分辨率的關鍵環(huán)節(jié)。而電子晶體學則對具有對稱結構的樣品進行三維重構具有很大的優(yōu)勢，比如二十面體病毒，螺旋對稱結構等，尤其適合膜蛋白的三維結構，并且是電子顯微術中目前只一能達到原子分辨率水平的方法。冷凍電子顯微鏡技術還將普遍應用于細胞組織的超微結構解析，對解開生命活動的規(guī)律和機制等產(chǎn)生更大影響。南通快速冷凍顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術，是一種重要的結構生物學研究方法。南通快速冷凍顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術揭示生物分子細節(jié)：冷凍電鏡可以通過揭示細胞里發(fā)生的生命過程細節(jié)，幫助人們了解很多有意思的生物學現(xiàn)象。比如，我們吃辣椒會覺得辣，是因為辣椒里有一種叫做辣椒素的小分子。辣椒素與位于舌頭神經(jīng)末梢的膜蛋白TPRV1結合，打開膜蛋白上的一個通道，讓細胞膜外面的離子向細胞膜內(nèi)部流動，這樣微小的流動產(chǎn)生的電流通過神經(jīng)纖維較終傳遞到我們的大腦，讓我們感受到辣的感覺。2013年，科學家利用冷凍電鏡技術，以近原子分辨率解析了膜蛋白TRPV1的通道結構，以及它與辣椒素相互結合的結構。人們由此了解到，實際上是由于辣椒素結合到4個亞基所組成的通道膜蛋白上把孔道撐開，才使得離子可以穿透。南通快速冷凍顯微鏡技術應用

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