凋亡因子(如caspase-3)、細菌du su(如白喉du suA鏈)在細胞內(nèi)表達會引發(fā)宿主死亡。體外蛋白表達系統(tǒng)通過無細胞環(huán)境規(guī)避毒性效應(yīng):在添加線粒體膜組分的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物中,全長BAX蛋白(21kDa)表達量達0.8mg/mL,并成功模擬其介導(dǎo)的細胞色素C釋放過程(CellDeathDiffer.,2024)。該系統(tǒng)還可表達HIV蛋白酶(活性>95%),用于高通量抑制劑篩選,加速抗病毒藥物開發(fā)。真he dan白的糖基化修飾(如抗體Fc段N-糖)是zhi liao性蛋白功能的he xin。傳統(tǒng)體外蛋白表達因缺乏高爾基體,糖基化效率不足5%。突破性方案是在HEK293裂解物中添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(含GnT-I、GnT-II、FUT8),使曲妥珠單抗的復(fù)雜雙觸角糖型比例升至80%(Science,2022)。結(jié)合UDP-GlcNAc底物連續(xù)補料,糖均一性(G0F:G2F=1:1.2)媲美哺乳細胞表達,為下一代抗體偶聯(lián)藥物(ADC)提供新生產(chǎn)路徑。我們需要先??構(gòu)建蛋白表達載體??,再轉(zhuǎn)染細胞。大腸桿菌重組蛋白表達技術(shù)
無細胞蛋白表達技術(shù)CFPS的開放體系特性使其對實驗環(huán)境極為敏感。裂解物中的酶活性會隨凍融次數(shù)下降,需分裝保存并避免反復(fù)凍融;反應(yīng)中核酸酶殘留可能導(dǎo)致模板降解,常需額外添加抑制劑(如RNasin)。此外,不同批次的裂解物活性可能存在差異,導(dǎo)致實驗結(jié)果難以重復(fù)。例如,某研究組發(fā)現(xiàn)同一模板在連續(xù)三次實驗中蛋白產(chǎn)量波動達30%,后來通過標(biāo)準(zhǔn)化裂解物制備流程(如固定細胞生長OD值)才解決該問題。這些細節(jié)要求使得CFPS的操作容錯率較低。低溫誘導(dǎo)蛋白表達發(fā)展前景體外蛋白表達憑借其速度與靈活性的雙重優(yōu)勢,在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)和即時診斷領(lǐng)域持續(xù)釋放價值。
無細胞蛋白表達技術(shù)(CFPS)的操作確實比傳統(tǒng)細胞表達更繁瑣,主要體現(xiàn)在多步驟的體系配置上。實驗者需要精確配制包含裂解物、能量混合物(ATP/GTP)、氨基酸、輔因子(Mg2?、K?)和DNA/mRNA模板的復(fù)雜反應(yīng)體系,且各組分濃度需嚴(yán)格優(yōu)化(如Mg2?濃度波動1 mM就可能導(dǎo)致表達失敗)。此外,裂解物制備本身涉及細胞培養(yǎng)、破碎、離心透析等步驟,若直接購買商業(yè)化裂解物(如RTS 100),單次成本可能高達數(shù)百元。對于新手而言,反應(yīng)條件的微調(diào)(pH、溫度、氧化還原環(huán)境)往往需要多次試錯,增加了實驗難度。
在合成生物學(xué)中,無細胞蛋白表達技術(shù)是構(gòu)建人工細胞和基因電路的he xin工具。研究人員通過混合不同物種(如大腸桿菌+哺乳動物)的裂解物,創(chuàng)建雜合翻譯系統(tǒng),以實現(xiàn)跨物種蛋白的協(xié)同合成。該技術(shù)還支持無細胞基因線路的快速原型設(shè)計,例如將CRISPR組分與報告蛋白共表達,用于體外診斷工具的開發(fā)。由于擺脫了細胞膜的限制,CFPS可直接整合非生物元件(如合成聚合物或納米材料),推動人工合成生命和生物-非生物雜合系統(tǒng)的前沿研究。無細胞蛋白表達技術(shù)可快速表達膜蛋白(如GPCRs、離子通道)用于藥物靶點研究,解決了此類蛋白在細胞內(nèi)難表達、易沉淀的問題。在診斷領(lǐng)域,基于CFPS的體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)被整合到便攜式設(shè)備中,用于現(xiàn)場檢測病原體核酸(如埃博拉病毒),實現(xiàn)“樣本進-結(jié)果出”的快速診斷。此外,該技術(shù)還能合成定制化抗原,用于抗體庫篩選或個性化cancer疫苗開發(fā)。芯片級體外蛋白表達平臺在個性化醫(yī)療中尤為關(guān)鍵,能夠幫助指導(dǎo)靶向藥物選擇。
體外蛋白表達(InVitroProteinExpression)是指在無完整活細胞的環(huán)境下(如試管、微孔板或芯片),利用生物提取物中的核糖體、tRNA、酶及能量系統(tǒng),直接將遺傳信息轉(zhuǎn)化為功能蛋白質(zhì)的技術(shù)。與傳統(tǒng)細胞依賴的系統(tǒng)不同,該技術(shù)完全避開了細胞膜屏障和基因復(fù)制過程,只通過添加目標(biāo)DNA/RNA模板及底物(氨基酸、ATP)即可啟動蛋白表達。這一過程通??稍?-4小時內(nèi)完成,其速度優(yōu)勢大幅加速了蛋白質(zhì)研究進程。無細胞蛋白表達系統(tǒng)的重點在于重構(gòu)翻譯機器,例如提取大腸桿菌裂解物中的核糖體,或利用兔網(wǎng)織紅細胞裂解物中的真核翻譯因子,以實現(xiàn)跨物種的高效蛋白表達。通過??優(yōu)化蛋白表達條件??,我們獲得了更高產(chǎn)量的酶。AI合成蛋白表達常見問題
不用養(yǎng)細胞,直接拿細胞內(nèi)部的“機器”(核糖體+酶)??在試管里進行蛋白表達??。大腸桿菌重組蛋白表達技術(shù)
無細胞蛋白表達技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如,在COVID-19期間,無細胞蛋白表達技術(shù)被用于數(shù)小時內(nèi)合成病毒抗原,加速疫苗候選物篩選。美國DARPA支持的“生物制造”項目利用凍干無細胞蛋白表達技術(shù)試劑,在戰(zhàn)場環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體,實現(xiàn)便攜式、無需冷鏈的即時生物制造。這類場景凸顯了無細胞蛋白表達技術(shù)在時效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求,無細胞蛋白表達技術(shù)可整合非天然氨基酸(通過修飾tRNA)、脂質(zhì)體(用于膜蛋白表達)或翻譯后修飾酶(如糖基化酶)。大腸桿菌重組蛋白表達技術(shù)