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差速離心法分離外泌體的實(shí)驗(yàn)原理：外泌體是一種小的(40-100nm)細(xì)胞外膜囊泡，目前進(jìn)行外泌體分離的普遍方法是差速離心法。應(yīng)用差速離心法和粒徑分析等是細(xì)胞外囊泡(EV)研究的重要步驟。已知細(xì)胞會(huì)分泌許多膜囊泡，這些囊泡的大小、分子含量及其形成機(jī)制各不相同具體取決于細(xì)胞的類型和當(dāng)前狀態(tài)。通?？梢员鎰e出三個(gè)主要的EV群體：凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體.凋亡小體是已知較大的囊泡，直徑為800-5000nm，由凋亡后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細(xì)胞釋放。脫落的囊泡，也稱為“胞外體”或有時(shí)稱為“微泡”，是由質(zhì)膜起泡產(chǎn)生的，一般的粒徑尺寸范圍為(50–1000nm)。分離過程中避免對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)和功能造成影響至關(guān)重要。杭州外泌體費(fèi)用

分離外泌體的方法之密度梯度超速離心：有助于根據(jù)尺寸、結(jié)構(gòu)和形態(tài)差異分離和分析納米級(jí)材料。DGUC“細(xì)化”分離的囊泡，并使用密度為1.07g/mL或更低的密度梯度培養(yǎng)基。水中碘沙醇、冰冷的PBS和蔗糖是用于外泌體分離的常見梯度培養(yǎng)基。有市售的碘沙醇密度梯度分餾膜，用于將外泌體與非囊泡成分分離。將生物懸浮液添加到梯度培養(yǎng)基中，并以完整的梯度分層組分。DGUC有助于分離具有相同梯度的樣品。凋亡小體、蛋白質(zhì)聚集體和其他非外泌體微囊泡可能通過超速離心干擾較終分離的外泌體產(chǎn)物。DGUC有助于克服超速離心的局限性，并提供較純凈的外泌體。DGUC在精細(xì)化和高性能外泌體分離方法中的應(yīng)用。簡(jiǎn)而言之，在分離細(xì)胞碎片后，應(yīng)用1×105g用60%碘沙醇離心3小時(shí)，然后用1×10離心5用40%碘沙醇g18小時(shí)有助于形成多達(dá)12個(gè)碘沙醇梯度級(jí)分和兩個(gè)外泌體級(jí)分。超速離心使用連續(xù)的密度梯度或逐步梯度來較小化這些顆粒材料對(duì)外泌體的干擾。長(zhǎng)春市外泌體企業(yè)外泌體可以通過非典型途徑進(jìn)行排毒，參與細(xì)胞解掉毒和化學(xué)治著的作用。

外泌體分離方法之過濾法：超濾膜也可用于外泌體的分離。根據(jù)微泡的大小，使用超濾膜過濾的方法可以將外泌體與蛋白質(zhì)和其他大分子分離。外泌體也可以通過多孔結(jié)構(gòu)捕獲它們來分離。常見的過濾膜孔徑為0.8m、0.45m或0.22m，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌體。比如微柱多孔硅纖毛結(jié)構(gòu)一般用于分離40-100nm外泌體。在初始步驟中，去除較大的囊泡。在接下來的步驟中，外泌體會(huì)群集中在過濾膜上。隔離步驟相對(duì)較短，但該方法需要用PBS緩沖液對(duì)硅結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)孵育。除標(biāo)準(zhǔn)過濾技術(shù)外，切向流過濾在有效分離外泌體方面也有著嘗試應(yīng)用，通過切向流過濾技術(shù)去除游離肽和其他小化合物從而分離具有確定大小的外泌體。此外，在體外研究和脂肪組織中，也會(huì)采用超濾與SEC的結(jié)合的方式來分離外泌體。通過(a)對(duì)片上過濾器施加壓力或(b)產(chǎn)生電場(chǎng)，迫使外泌體穿過多孔膜，結(jié)合錯(cuò)流和電泳分選來完成篩分。

外泌體衍生物miRNA的重要應(yīng)用：外泌體保護(hù)miRNA免于降解，使它們比游離miRNA更穩(wěn)定，并能被特定受體細(xì)胞有效整合。因此，在外泌體攜帶的貨物中，miRNA可以提供有關(guān)它們來源的細(xì)胞類型、靶標(biāo)和細(xì)胞狀態(tài)的身份信息。越來越多的證據(jù)表明，疙瘩細(xì)胞來源的外泌體已成為通過傳遞病miRNA促進(jìn)疙瘩細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疙瘩微環(huán)境重塑的主要候選者。血管生成對(duì)于惡性疙瘩的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，因?yàn)樾卵芸梢蕴峁╊~外的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以清理廢物。比如：病細(xì)胞釋放外泌體exo-miR-21、exo-miR-23；外-miR-29；exo-miR-103和exo-miR-210可以促進(jìn)增殖、血管生成和疙瘩轉(zhuǎn)移。外泌體與肺的關(guān)系密切，通過氣道和肺泡微環(huán)境的打開和修飾，參與肺疾病如肺結(jié)核、肺病等的發(fā)生和發(fā)展。

差速離心法分離外泌體的實(shí)驗(yàn)原理：離心管內(nèi)粒子的速度，由三種力（離心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力）的平衡決定，如：其中g(shù)eff為離心力（加速度），R為旋轉(zhuǎn)半徑，即粒子距旋轉(zhuǎn)軸的距離，ω為旋轉(zhuǎn)角頻率，d為粒子直徑，ρ為質(zhì)量粒子的密度和ρsolv和η分別是介質(zhì)的密度和粘度。在固定的離心條件（轉(zhuǎn)速和介質(zhì)成分）下，粒子速度完全由粒子的形態(tài)和密度決定。密度高于介質(zhì)密度的粒子沿離心力“向下”運(yùn)動(dòng)，而比介質(zhì)輕的粒子沿與離心力相反的方向“上浮”。對(duì)于相似的密度，較大的粒子遷移得更快。因此，在生物學(xué)中，離心主要用于按大?。ú钏俸退俾蕝^(qū)帶離心）或按密度（等密度離心）分離不同的物體。在這項(xiàng)研究中，我們專注于使用差速離心按大小進(jìn)行顆粒分級(jí)。外泌體分離是外泌體研究中的重要步驟。深圳細(xì)胞外泌體報(bào)價(jià)表

手動(dòng)超高速離心和自動(dòng)化離心儀器的分離效果可能存在差異。杭州外泌體費(fèi)用

外泌體的表征分析：動(dòng)態(tài)光散射：使用Anton-PaarLightsizer500粒子分析儀測(cè)定外泌體制劑中的粒度分布。動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量由于溶液中粒子的布朗運(yùn)動(dòng)引起的散射光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)波動(dòng)，（685nm的激光，檢測(cè)角度為15、90、175度）；較小的粒子比較大的粒子移動(dòng)得更快。確定顆粒大小時(shí)，通常使用三種分布類型：(1)數(shù)量分布，報(bào)告不同大小“箱”中的顆粒數(shù)量；(2)體積分布報(bào)告不同尺寸類別的顆?？傮w積；(3)強(qiáng)度分布，報(bào)告不同大小顆粒散射的光。也可以使用高分辨率納米粒徑分析儀NanocoulterⅠ來分析樣品中每種大小的囊泡的實(shí)際數(shù)量、濃度及粒子動(dòng)態(tài)、Zeta電位等。為了進(jìn)行分析，將先前儲(chǔ)存在-20°C的75μl等分試樣的外泌體制劑用925μlPBS稀釋（得到1ml）并轉(zhuǎn)移到一次性比色皿中用于DLS測(cè)量。杭州外泌體費(fèi)用

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