上海微滴式數(shù)字PCR儀器

PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)，即聚合酶連反應(yīng)，是一種擴大和復(fù)制目的片段DNA的技術(shù)，其發(fā)現(xiàn)對于生命科學(xué)的發(fā)展具有重要的意義。而3D數(shù)字PCR到底是什么鬼？它其實是出現(xiàn)的一款PCR儀，其具有對目的DNA分子做出定量的優(yōu)點，進(jìn)而提供的準(zhǔn)確性、靈敏度。應(yīng)用該技術(shù)，實現(xiàn)對DNA進(jìn)行精確定量，精確度可通過復(fù)制次數(shù)實現(xiàn)。通過準(zhǔn)確性的進(jìn)行定量檢測基因，有助于臨床上在、病毒等疾病作參考。同時，其具有高通量，檢測速度快，成本相對低等優(yōu)點，為后期精細(xì)奠定基礎(chǔ)。dPCR的結(jié)果統(tǒng)計方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色，另一種采用概率統(tǒng)計的數(shù)據(jù)處理方法。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

常規(guī)PCR和實時熒光PCR定量檢測都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測定在各種條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴增動力學(xué)影響，可以進(jìn)行定量。如何在雙通道設(shè)置及雙探針標(biāo)記的情況下實現(xiàn)多重檢測?不同位點的雙探針檢測體系中引物和探針采用不同的終濃度，這樣陽性微滴的終點FAM/HEX熒光信號強度就會不同，利用陽性微滴不同的“分簇(cluster)”來區(qū)分不同的突變位點。采用對應(yīng)的KRAS野生型和突變型細(xì)胞系對雙重ddPCR檢測體系的性能進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示除了Q61H位點外，其他位點的檢測體系在54C的情況下均能很好的區(qū)分4個明顯的cluster。珠三角銳訊數(shù)字PCR系統(tǒng)通過“儀器+試劑”相互配合的方式，打出了數(shù)字PCR檢測的“組合拳”。

數(shù)字PCR系統(tǒng)的分散方式?jīng)Q定了分散數(shù)量，其結(jié)果基于統(tǒng)計的方法進(jìn)行定量，增加反應(yīng)單元數(shù)量（統(tǒng)計樣本量），可以增加其檢測的容量和動態(tài)檢測線性范圍達(dá)到和qPCR相近的動態(tài)范圍，同時減小一個反應(yīng)單元中包含多個分子所造成的誤差，達(dá)到提高靈敏度和準(zhǔn)確度。影響dPCR定量結(jié)果的因素包括：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定，分散體積和結(jié)果表達(dá)方式需要實驗人員在實驗過程中優(yōu)化得到。

在使用dPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時，通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術(shù)對相同樣品檢測時，兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關(guān)注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765個微單元）芯片數(shù)字PCR分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD413檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810。該小組應(yīng)用dPCR技術(shù)評估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值，在拷貝數(shù)200-700之間，dPCR與qPCR的測量結(jié)果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比，dPCR在低于拷貝數(shù)200時有被低估的風(fēng)險，在高于拷貝數(shù)1000時有被高估的風(fēng)險。dPCR在同一陣列上同時測量轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性靶點時，需要稀釋內(nèi)源性靶點和轉(zhuǎn)基因靶點在合理拷貝數(shù)范圍內(nèi)以保證dPCR測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。數(shù)字PCR具有諸多優(yōu)點，但也存在一定的不足，如成本高、儀器操作復(fù)雜、經(jīng)濟效益低等。

數(shù)字PCR系統(tǒng)通過其獨特的微流體陣列式芯片板（MAP）技術(shù)，提供強大而易于使用的數(shù)字PCR體驗。這種專有技術(shù)可實現(xiàn)對樣品進(jìn)行一致的自動腔室化，可將一份樣品腔室化至20,000個微反應(yīng)室，其變異系數(shù)（CV）達(dá)到比較好的<1%。與其它數(shù)字PCR系統(tǒng)不同，MAP技術(shù)不使用乳液或其它基于液滴的方法對反應(yīng)進(jìn)行腔室化。而是利用分配通道將試劑遞送至微反應(yīng)室，具有高精密度和一致性。此外，QuantStudioAbsoluteQ系統(tǒng)可分析加載樣品的95%以上，確保獲得高度準(zhǔn)確的數(shù)字PCR結(jié)果。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

現(xiàn)有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴增產(chǎn)物。這些方法要求足夠的靶分子擴增以產(chǎn)生足以被檢測到的信號，但可能會導(dǎo)致額外的錯誤或偏差，因此，希望能夠提供一種改進(jìn)的、用于檢測樣品內(nèi)感興趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的準(zhǔn)確度和精確度，并且其具有可以與基于dPCR的方法關(guān)聯(lián)使用的靈敏度。dPCR還在樣品內(nèi)進(jìn)行單一反應(yīng)，但是所述樣品被分離成大量的分區(qū)(partition)，并且所述反應(yīng)在每個分區(qū)中單獨進(jìn)行。這種分離允許對核酸量進(jìn)行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異，例如拷貝數(shù)變異或點突變。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

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